Kilka dni temu w Nature Communications ukazała się publikacja pt. Secondary Structure Prediction for RNA Sequences Including N⁶-methyladenosine autorstwa E. Kierzek (współautor do korespondencji), X. Zhang, R. Watson, S. Kennedy, M. Szabat, R. Kierzek i D.H. Mathews (OA: Nature Communications, 13, 1271, 2022). Powstała ona dzięki współpracy profesor Elżbiety Kierzek, doktor Marty Szabat oraz profesora Ryszarda Kierzka z grupą badawczą profesora Davida H. Mathewsa z Department of Biochemistry and Biophysics University of Rochester w USA. Praca dotyczy przewidywania fałdowania RNA zawierających N⁶-metyloadenozyny z wykorzystaniem rozszerzonego na podstawie badań eksperymentalnych programu komputerowego RNAstructure. Obok pseudourydyny właśnie N⁶-metyloadenozyna (m⁶A) jest najczęściej spotykaną naturalną modyfikacją RNA. Występuje w ewolucyjne zachowawczych rejonach RNA (długich wewnętrznych eksonach, 3’UTR, w pobliżu kodonów stop) w mRNA, rRNA, tRNA oraz ncRNA pochodzących z różnych organizmów. Przewiduje się, że w genomie człowieka N⁶-metyloadenozyna występuje około 200 tysięcy razy i spełnia różne funkcje biologiczne, miedzy innymi w RNA, które są związane z chorobami nowotworowymi, zaburzeniami metabolizmu, immunoregulacją oraz neurodegradacją. Praktycznie wszystkie wirusy RNA (np. wirusy grypy, dengi, Zika, Zachodniego Nilu, HCV, HIV, SARS-CoV-2) zawierają N⁶-metyloadenozynę, a jej funkcja jest mało poznana.

            W celu rozszerzenia zakresu struktur przewidywanych przez RNAstructure także o takie RNA, które zawierają N⁶-metyloadenozynę wyznaczono 15 parametrów termodynamicznych określających reguły fałdowania się RNA zawierających tę modyfikację. Parametry zostały określone w oparciu o trwałość termodynamiczną 45 modelowych RNA zawierających N⁶-metyloadenozynę w różnych aranżacjach strukturalnych. Do pomiarów użyto metody topnienia dupleksów monitorowanej w zakresie UV (UV-melting). Następnie parametry termodynamiczne uzyskane dla N⁶-metyloadenozyny zostały włączone do systemu algorytmów programu RNAstructure, który w swojej dotychczasowej formie pozwalał przewidzieć strukturę RNA zwierających jedynie A, C, G i U.

Poprawność przewidywanej przez zmodyfikowany program RNAstructure struktury RNA zawierającej N⁶-metyloadenozynę zbadano na fragmencie lncRNA MALAT1 (ang. metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript). Był to fragment RNA tworzący spinkę z N⁶-metyladenozyną ulokowaną w rejonie trzonu. Struktura RNA wygenerowana za pomocą zmodyfikowanego programu RNAstructure nie wykazała istotnych zmian strukturalnych w rejonie trzonu spinki, a jedynie mniejszą stabilność termodynamiczną tego fragmentu. Obserwacje te potwierdziło mapowanie chemiczne struktur tych samych dwóch spinek, z których jedna zawierała A, a druga m⁶A. Również i w tym przypadku struktury obu spinek RNA były praktycznie identyczne. Przeprowadzono również badania NMR tych samych spinek, zarówno w obecności różnych stężeń kationów magnezowych, jak i przy ich braku. Także w tym przypadku widma NMR sugerowały jedynie osłabienie strukturalne w rejonie zawierającym N⁶-metyloadenozynę, bez rearanżacji strukturalnych spinki RNA wywołanej obecnością m⁶A.

            Wykorzystując zmodyfikowany dla m⁶A program RNAstructure przeprowadzono analizę strukturalną 18026 mRNA, o których wiadomo, że zawierają fragmenty RNA podatne na N⁶-metylowanie (N⁶-methylation sites), a dodatkowo ich struktury były uprzednio mapowane enzymami S1 i V1 (metodą PARS). Do badań strukturalnych wybrano fragmenty 800-nukleotydowe, gdyż wcześniejsze badania wykazały, że fałdowanie takiej długości fragmentów RNA jest identyczne jak w całym mRNA. Przeprowadzona analiza strukturalna wykazała znaczne mniejsze prawdopodobieństwo utworzenia struktury helikalnej w obrębie N⁶-methylation site wtedy, gdy zamiast adenozyny występowałaby tam N⁶-metyloadenozyna.

            Te ostatnie wyniki, w połączeniu z rezultatami dotyczącymi mapowania chemicznego oraz badaniami strukturalnymi z wykorzystaniem NMR, dobrze korelują z mechanizmem enzymatycznego N⁶-metylowania i funkcją N⁶-metyloadenozyny. W powstawaniu i funkcjonowaniu tej post-transkrypcyjnej modyfikacji biorą udział trzy grupy białek. Pierwsze z nich metylują adenozynę w pozycji N⁶ (metylotransferazy, tzw. writers), kolejne to białka wiążące się do rejonów RNA zawierających N⁶-metyloadenozynę (tzw. readers), a ostatnie w tej grupie to białka usuwające grupę metylową z pozycji N⁶ adenozyny (demetylazy, tzw. erasers).

Opisane w pracy właściwości termodynamiczne i strukturalne m⁶A RNA, połączone z dotychczasową wiedzą na temat funkcji N⁶-metyloadenozyny w RNA sugerują, że może być ona kluczowym elementem bardzo precyzyjnego strukturalnego przełącznika w obrębie naturalnych RNA.

Publikacja jest dostępna pod adresem:

https://www.nature.com/articles/s41467-022-28817-4